Résumé : 1 Introduction générale.
2 Fonction et régulation de la cytochrome c oxydase.
2.1 Les chaînes respiratoires.
2.1.1 La chaîne respiratoire mitochondriale.
2.1.1.1 Le complexe I.
2.1.1.2 Le complexe II.
2.1.1.3 Le pool quinone.
2.1.1.4 Le complexe III.
2.1.1.5 Le cytochrome c.
2.1.1.6 Le complexe IV.
2.1.1.7 L'ATP synthase.
2.1.1.8 Les supercomplexes.
2.1.2 Les chaînes respiratoires de Paracoccus denitrificans.
2.2 La Cytochrome c Oxydase.
2.2.1 Structure de l§oxydase aa3 de Paracoccus denitrificans.
2.2.1.1 La sous-unité I et le site actif.
2.2.1.2 La sous-unité II.
2.2.1.3 La sous-unité III.
2.2.1.4 La sous-unité IV.
2.2.1.5 Autres métaux (hors transfert d'électrons).
2.2.2 Structure de l§oxydase mitochondriale.
2.2.3 Mécanisme fonctionnel.
2.2.3.1 Transfert d§électrons.
2.2.3.2 Cycle catalytique.
2.2.3.3 Transfert de protons.
2.3 Le Monoxyde d'azote (NO).
2.3.1 Généralités.
2.3.2 Le NO chez les mammifères.
2.3.2.1 Production in vivo.
2.3.2.2 Rôles physiologiques.
2.4 Cytochrome c oxydase et monoxyde d'azote.
2.4.1 Le NO inhibe la cytochrome c oxydase.
2.4.2 Réactions de NO avec l'oxydase.
2.4.3 Implications physiologiques.
3 Matériel et Méthodes.
3.1 Microbiologie.
3.1.1 Paracoccus denitrificans.
3.1.2 Escherichia coli.
3.1.3 Conjugaison.
3.2 Biologie moléculaire.
3.2.1 Mutagenèse dirigée.
3.2.2 Amplification et purification des plasmides.
3.3 Biochimie.
3.3.1 Gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes (SDS-PAGE).
3.3.2 Coloration des hèmes c.
3.3.3 Test NADI.
3.3.4 Dosage des protéines.
3.3.5 Purification de l'oxydase aa3 de Paracoccus denitrificans.
3.3.5.1 Isolement des membranes.
3.3.5.2 Solubilisation.
3.3.5.3 Chromatographie échangeuse d'ions de l'oxydase aa3.
3.3.6 Purification de la cytochrome c oxydase de c?ur de b?uf.
3.3.6.1 Isolement des mitochondries.
3.3.6.2 Purification de la cytochrome c oxydase.
3.3.7 Préparation des échantillons: oxydases et ligands gazeux.
3.4 Spectroscopie.
3.4.1 Spectroscopie à l'équilibre.
3.4.2 Spectroscopie femtoseconde.
3.4.2.1 Principe de fonctionnement.
3.4.2.2 Description de l'expérience d'absorption femtoseconde.
3.4.3 Spectroscopie d'absorption nanoseconde.
3.4.4 La résonance paramagnétique électronique (RPE).
3.5 Modélisation.
4 Résultats et Discussion.
4.1 Purification des protéines.
4.1.1 Oxydase aa3 de Paracoccus denitrificans.
4.1.1.1 Mise au point des conditions de culture.
4.1.1.2 Solubilisation.
4.1.1.3 Chromatographie de l'oxydase aa3.
4.1.1.4 Rendement et pureté de l'échantillon.
4.1.2 - Oxydase mitochondriale.
4.1.2.1 Isolement des mitochondries.
4.1.2.2 Purification de l'oxydase.
4.2 Interactions entre la cytochrome c oxydase aa3 bactérienne et le monoxyde d'azote.
4.2.1 Spectroscopie à l'équilibre.
4.2.2 Spectroscopie ultrarapide.
4.2.3 Spectroscopie nanoseconde.
4.2.4 Spectroscopie RPE.
4.2.5 Discussion.
4.2.5.1 Cinétiques de recombinaison: CcO aa3.
4.2.5.2 L'oxydase ba3.
4.2.5.3 Résultats RPE.
4.2.5.4 Modélisations moléculaires.
4.2.6 Conclusion.
4.3 Transfert d'électrons dans la cytochrome c oxydase mitochondriale.
4.3.1 Spectroscopie à l'équilibre.
4.3.1.1 Spectre UV/visible de l'oxydase
4.3.1.2 Formation de l'état "mixed valence" (MV).
4.3.1.3 Caractéristiques spectrales de l'état MV.
4.3.2 Spectroscopie résolue dans le temps.
4.3.2.1 Spectres de photodissociation.
4.3.2.2 Evolution spectrale et transfert d'électrons.
4.3.2.3 Discussion.
4.3.2.4 Perspectives.
4.4 Mutagenèse de l'oxydase aa3 de P. denitrificans.
4.4.1 Modélisation moléculaire.
4.4.2 Création des mutants.
4.4.3 Tests biochimiques.
4.4.4 Perspectives.
5 Conclusion et Perspectives.
6 Annexes, Index et Références.
6.1 Abbréviations.
6.2 Références bibliographiques.
6.3 Articles.