Résumé : L§endoribonucléase de restriction RegB est une enzyme produite par le bactériophage T4. Elle est impliquée dans la transition phase précoce-phase moyenne durant le cycle lytique du virus. RegB coupe avec une spécificité quasi absolue la séquence GGAG impliquée notamment dans l§initiation de la traduction chez la bactérie Escherichia coli.
Nous avons caractérisé dans cette thèse de façon précise la toxicité de RegB dans la bactérie et nous avons proposé des outils pour contourner cette toxicité tels la manipulation du nombre de copies du vecteur d§expression ou l§atténuation de l§efficacité du site d§initiation de la traduction. Nous avons, par ailleurs, proposé une application de RegB pour la construction d§un vecteur de clonage à sélection positive et à expression duale dans les systèmes procaryotes et eucaryotes.
L§étude par RMN du 31P de la cinétique de clivage d§un ARN par RegB a permis de définir RegB comme une "transphosphorylase libérant un phosphodiester 2§, 3§-cyclique". Des études de mutagenèses dirigées et aléatoires combinées à l§évolution du gène regB dans un virus apparenté au phage T4 (le virus RB49) ont mis en évidence le rôle des résidus Glutamate 19, Histidine 48, Arginine 52 et Histidine 68 dans l§activité de RegB.
Le mutant RegB H48A a été choisi pour construire un modèle structural du site actif de RegB. L§attribution séquentielle de cette protéine par RMN hétéronucléaire 1H/15N/13C a été entreprise avec succès.Table des matières
Introduction - 7
1.1 L§activité ribonucléase est associée à quatre niveaux d§organisation macromoléculaire - 9
1.1.1 Une simple chaîne ribonucléique - 9
1.1.2 Une chaîne ribonucléique associée à une chaîne peptidique: la RNase P - 11
1.1.3 Une seule chaîne polypeptidique - 13
1.1.4 Un complexe multiprotéique: Exemple du dégradosome d§E. coli et de l§exosome de la S. cerevisiae - 15
1.2 La spécificité de coupure chez les ribonucléases - 17
1.2.1 Clivage d§une classe particulière d§ARN - 17
1.2.2 Clivage d§un ARN simple brin ou d§un ARN double brin - 17
1.2.3 Clivage d§un ARN dans une structure nucléique hybride - 19
1.2.4 Clivage spécifique après une base particulière - 19
1.2.5 Clivage au niveau d§un contexte séquentiel particulier - 20
1.2.5.1 La colicine E5: une RNAse de restriction qui reconnaît le motif Q(G)U - 21
1.2.5.2 La restrictocine - 22
1.3 L§endoribonucléase de restriction RegB - 24
1.3.1 Le cycle lytique du phage T4 dans E. coli - 24
1.3.2 La découverte du gène regB - 25
1.3.3 RegB est une endoribonucléase séquence-spécifique - 26
1.3.4 L§activité de RegB est stimulée in vitro par la protéine ribosomique S1 - 27
1.3.5 Recherche de l§information supplémentaire portée par l§ARN et identifiable par RegB - 27
1.4 Présentation du travail de recherche que nous avons mené sur RegB - 29
Chapitre 1 Expression de la ribonucléase RegB - 30
1.1 Le système d'expression pET - 31
1.2 RegB ne peut être maintenue in vivo dans un vecteur pET classique - 33
1.2.1 Preuve expérimentale - 33
1.2.2 Des systèmes d'expression plus fermés sont nécessaires - 35
1.3 Expression de RegB à partir d§un vecteur pET contenant un RBS Phi 10 modifié - 36
1.3.1 RegB se maintient dans un vecteur pET contenant un RBS peu efficace - 36
1.3.2 Adaptation du système RBS Phi 10 atténué / lCE6 à la culture en fermenteur - 39
1.4 Expression de RegB en couplant la stratégie pET à une origine de réplication thermorégulable
1.4.1 Construction du vecteur d§expression pOURegB - 41
1.4.1.1 Le nombre de copies du plasmide pOU61 est thermorégulable - 41
1.4.1.2 Caractéristique du plasmide pOURegB - 44
1.4.2 Expression de la ribonucléase RegB avec le système pOURegB - 45
1.5 Expression de RegB dans un système eucaryote - 49
1.5.1 Justification du choix - 49
1.5.2 Construction des vecteurs d§expression pYRegB1 et pYRegB2 - 49
1.6 Avantages et inconvénients des différents systèmes d'expression de RegB - 53
1.7 Mise au point d'un nouvel outil d'ingénierie génétique exploitant le système RegB - 54
1.7.1 Principe - 54
1.7.2 Particularité du système de sélection positive utilisant RegB - 54
1.7.3 Construction du vecteur pTOXR-1 - 55
1.7.4 Le système de sélection positive de pTOXR-1: Application au clonage du bimodule 4-5 de la protéine ribosomique S1 - 57
1.7.5 Le système d§expression duale de pTOXR-1 - 59
1.7.6 Perspectives d§utilisation du plasmide pTOXR-1 - 60
Chapitre 2 Caractérisation du chemin réactionnel catalysé par RegB - 61
2.1 La liaison phosphodiester - 63
2.2 Clivage de la liaison O3§-P - 64
2.3 Clivage de la liaison P-O5§ - 66
2.3.1 Hydrolyse de la liaison P-O5§: Exemple de la nucléase staphylococcale - 67
2.3.2 Clivage de la liaison P-O5§ par transfert du groupement phosphate: la RNase A - 68
2.4 RegB libère une extrémité 3§ Phosphate - 70
2.5 Suivi cinétique par RMN du 31P de la réaction catalysée par RegB - 71
2.5.1 Principe - 71
2.5.2 Choix d§un modèle expérimental de coupure par RegB - 73
2.5.3 Identification du produit de coupure - 75
2.5.4 Conclusion et conséquences - 77
Chapitre 3 Investigation par mutagenèse aléatoire de la structure primaire de RegB - 78
3.1 La stratégie de mutagenèse aléatoire par PCR - 80
3.2 Mutagenèse aléatoire de RegB et stratégie de sélection - 81
3.3 Résultats de la mutagenèse de la partie 5§ du gène regB (partie N-terminale de RegB) - 85
3.4 Résultats de la mutagenèse de la partie 3§ du gène regB (partie C-terminale de RegB) - 88
Chapitre 4 Investigation par mutagenèse dirigée de la partie N-terminale de RegB - 91
4.1 Résidus aminés impliqués dans le mécanisme catalytique des ribonucléases de la famille des transphosphorylases - 93
4.1.1 Le groupe de la RNase A - 93
4.1.2 Le groupe de la RNase T1 - 94
4.1.3 Le groupe de la RNase T2 - 96
4.1.4 Le groupe de Barnase - 97
4.2 Sélection des résidus Histidines à muter - 99
4.3 Mutagenèse dirigée des Histidines 42, 48, 68 et 73 - 100
4.4 Caractérisation in vivo de l§effet des mutations histidine-en-alanine - 101
4.5 Etude des cinétiques de coupure de l§ARN Selex22tb par les différents mutants de RegB - 102
4.6 Etude par RMN de la structure globale des mutants H48A et H68A - 104
4.7 Quantification par Résonance Plasmonique de Surface de la liaison des mutants de RegB à l§ARN substrat - 106
4.8 Discussion des rôles des Histidines 48 et 68 - 111
Chapitre 5 Evolution naturelle du gène regB dans un virus apparenté au phage T4: Etude du phage RB49 - 112
5.1 Séquençage du gène regB du phage RB49 - 114
5.2 Comparaison des séquences des protéines RegB du phage T4 et du phage RB49 - 115
Chapitre 6 Etude de la structure tridimentionelle de RegB par RMN: Mise au point de la stratégie - 119
6.1 Choix de la version de RegB - 121
6.2 Détermination des conditions spectroscopiques d§étude de RegB H48A - 123
6.2.1 La température - 123
6.2.2 pH, force ionique et molécule tampon - 124
6.3 Double marquage 13C/15N de RegB H48A - 125
6.4 Spectres RMN préliminaires - 126
Chapitre 7 Etude de la structure tridimentionelle de RegB par RMN: Début de l'attribution séquentielle de la protéine - 129
7.1 La procédure globale - 132
7.2 Les expériences RMN utilisées - 132
7.3 Recherche des enchaînements séquentiels - 134
7.3.1 Principe - 134
7.3.2 Exemple d§enchaînement - 135
7.4 Projection d§un enchaînement séquentiel sur la structure primaire de RegB H48A - 136
7.5 Limites de la stratégie d§attribution choisie - 138
Conclusion - 140
Matériels et méthodes - 143
Références bibliographiques - 166
Annexes - 184
Publications - 188